1940年秋，國民黨頑固派乘國際形勢的變化，加劇反共活動，將反共重心由華北轉到華中，掀起了第二次反共高潮。國民黨先是一再命令長江以北的新四軍全部開到長江以南指定的狹小地區，企圖割斷新四軍與八路軍的聯系，便于各個擊破。在中共中央針鋒相對地進行斗爭以后，1940年10月19日，蔣介石授意參謀總長何應欽、副參謀總長白崇禧發出皓電，強令黃河以南的八路軍、新四軍于1個月內全部開到災情和敵情并重的黃河以北，欲陷八路軍、新四軍于絕境。中共中央面對國民黨頑固派步步緊逼的反共分裂活動，從顧全抗日大局出發，以國家民族利益為重，及時提出挽救危局的方針和政策。11月15日，毛澤東致電周恩來和各戰略區負責人，闡明中共中央的基本方針和政策：“對于蔣介石此次反共進攻，決對皖南取讓步政策（即北移），對華中取自衛政策，而在全國則發動大規模反投降、反內戰運動，用以爭取中間勢力，打擊何應欽親日派的陰謀挑釁，緩和蔣介石之反共進軍，拖延抗日與國共合作時間，爭取我在全國之有理有利地位”。但國民黨已調兵遣將，在皖南集中了七個師8萬余人的大軍，以上官云相為總指揮，采取前堵后追、兩翼夾擊的部署，伺機圍殲勢單力薄的新四軍軍所軍所屬皖南部隊。1941年1月4日，新四軍軍部和所屬皖南部隊9000余人，為顧全團結抗戰大局，在軍長葉挺、副軍長項莢率領下，由安徽省涇縣云嶺出發，準備繞道茂林、三溪、寧國、郎溪，到江蘇省溧陽待機北渡。6日，蔣介石得知新四軍轉移，下令第三戰區、第五戰區“采取行動”。第三戰區于6日下午命令第三十二集團軍“迅速部署所部開始進剿”，“徹底加以肅清”。7日拂曉，當新四軍北移部隊行至涇縣以東茂林山區時．即遭到國民黨軍層層堵截和進攻。新四軍指戰員在葉挺指揮下，被迫奮起自衛，浴血苦戰8晝夜，到14日，終因寡不敵眾，彈盡糧絕，除約2000余人分散突出重圍外，一部被打散，大部犧牲和被俘。葉挺根據中共中央東南局副書記饒漱石的意見，14日下午準備同國民黨軍談判，竟被扣押。政治部主任袁國平、宣傳教育部部長朱鏡我、第二縱隊司令員周桂生、音樂家任光在突圍時犧牲。副軍長項英和副參謀長周子昆在蜜蜂洞隱蔽時遭叛徒殺害。1月17日，國民黨政府軍事委員會發表命令和談話，反誣新四軍為“叛軍”，宣布撤銷其番號，將葉挺“交軍法審判”，后將葉挺監禁五年零二個月。抗日戰爭勝利后，葉挺才于1946年3月4日被營救出獄。出獄第二天，他即致電中共中央和毛澤東，要求加入中國共產黨。1946年4月8日，葉挺由重慶赴延安；因飛機失事，在山西省興縣黑茶山遇難。為了紀念這位新四軍的第一任軍長，1948年，中共華中工作委員會和華中行政辦事處將鹽城縣改名為葉挺市。
皖南事變是國民黨在抗日戰爭中破壞國共合作的最大慘案。1月18日，中共中央發言人發表談話，全面揭露國民黨頑固派制造皖南事變的真相。在重慶的周恩來同國民黨頑固派進行了面對面的斗爭，親筆寫下了滿懷悲憤的題詞和挽詩：“為江南死國難者志哀”，“千古奇冤，江南一葉，同室操戈，相煎何急!?”并沖破國民黨新聞檢查機關的查禁，發表在1月18日的《新華日報》上，有力地控訴了國民黨頑固派的暴行。1月20日，中共中央軍委發表毛澤東起草的命令和發言人談話，任命陳毅為新四軍代理軍長、張云逸為副軍長、劉少奇為政治委員、賴傳珠為參謀長、鄧子恢為政治部主任，重建新四軍軍部。談話提出了嚴懲禍首、取消1月17日反動命令等12條解決皖南事變辦法。中國共產黨的正義自衛立場，得到全國各族人民、各民主黨派、海外僑胞和國際進步輿論的同情和支持。