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　　1938年2月15日，毛澤東即致電項英、陳毅：“力爭蘇浙皖邊發展游擊戰。但在目前最有利于發展地區，還在江蘇境內的茅山山脈，即以溧陽、溧水地區為中心，向著南京、鎮江、丹陽、金壇、宜興、長興、廣德線上之敵作戰，必能建立根據地。”4月24日，毛澤東致電項英，指示新四軍“主力開涇縣、南陵一帶，先派支隊去溧水一帶偵察”，“惟須派電臺及一有軍事知識之人隨去。”根據中共中央的指示精神，新四軍組建先遣支隊于4月28日從皖南出發，深入蘇南敵后進行戰略偵察。先遣支隊由第一、第二、第三支隊抽調團以下干部和偵察連組成，第二支隊副司令粟裕擔任司令員，第一支隊第一團政治處主任鐘期光為政治部主任。先遣支隊進入日軍已占領城鎮的蘇南淪陷區，分三個組對南京、常州、鎮江方向進行武裝偵察，調查了解淪陷區的狀況，搜集敵人情報。先遣支隊所到之處，大力開展民運工作和統戰工作，揭露日軍的侵華罪行，宣講抗戰國策和共產黨、新四軍的抗日主張。各路偵察人員還測繪地圖，調查蘇南的風土習俗，為主力部隊挺進茅山作了必要的準備。6月11日，國民黨第三戰區司令長官命令新四軍派兵一部挺進南京、鎮江之間破壞京滬鐵路，先遣支隊于6月15日完成破路任務后，為進一步擴大戰果，于6月17日在鎮江西南之韋崗伏擊日軍車隊，取得新四軍在江南的首戰勝利。先遣支隊完成任務后，于6月下旬撤銷，指戰員各回原部歸建。

　　1938年9月，中共中央在延安召開了六屆六中全會，會議強調抗日相持階段即將到來，敵后游擊戰爭將要變成抗戰的主要形式。共產黨的工作重點要放在戰區和敵后，獨立自主地放手組織人民抗日武裝，建立和鞏固更多的抗日根據地，縮小敵之占領區，配合正面戰場作戰。會議確定了大力鞏固華北、發展華中的戰略方針。會議認為“華中為我最重要的生命線”，于是“發展華中”不僅是新四軍的戰斗任務，而且成為共產黨、八路軍、新四軍共同的戰略任務。為此，中共中央做出了一系列重大部署：撤銷中共中央長江局，成立中共中央南方局和中共中央中原局；派周恩來視察皖南，批準葉挺過江整理江北部隊，派劉少奇進入華中，派黃克誠率八路軍主力一部南下華中，令新四軍江南部隊主力北渡，并陸續從延安、中共中央北方局、八路軍總部抽調大批干部支援華中等。
　　1939年2月，中共中央軍委副主席周恩來偕葉挺到達云嶺軍部，對新四軍的發展方向，周恩來提出了三個原則：一、那個地方空虛，我們就向那個地方發展；二、那個地方危險，我們就到那個地方去創造新的活動地區；三、那個地方只有敵人偽軍，友黨友軍較不注意沒有去活動，我們就向那里發展。這樣可以減少摩擦，利于統戰。在云嶺期間，周恩來還與新四軍領導人共同商定了關于新四軍的行動方針問題，由新四軍“向北發展、向東作戰、鞏固現在陣地”的戰略決策，最后概括為“向南鞏固、向東作戰、向北發展”的戰略方針。

　　1938年春，新四軍為了中國人民最根本的利益，肩負起民族的希望，不畏艱險，沖破重重限制和刁難，以最快的速度集中起來，并及時地深入到東線敵后開展抗日游擊戰爭，從日偽軍手中收復失地，迅速地創立敵后抗日根據地。
　　新四軍是由堅持南方三年游擊戰爭的紅軍游擊隊組建的，他們擅長于山地游擊戰，而沒有或缺乏平原水網地區游擊戰爭的經驗，但隨著八路軍在華北地區的抗戰實踐，在平原地區通過開展抗日游擊戰爭并建立抗日根據地的問題已經逐步解決，并取得了一定的經驗。1938年5月4日，毛澤東關于新四軍應進行敵后游擊戰爭致項英電，電文指出：“在敵后進行游擊戰爭雖有困難，但比在敵前同友軍一道并受其指揮反會要好些，方便些，放手些。”“在偵探部隊出去若干天之后，主力就可準備跟進，在廣德、蘇州、鎮江、南京、蕪湖五區之間廣大地區創造根據地，發動民眾的抗日斗爭，組織民眾武裝，發展新的游擊隊，是完全有希望的。在茅山根據地大體建立起來后，還應準備分兵一部進入蘇州、鎮江、吳淞三角地區去，再分一部渡江進入江北地區。”這是中共中央及其領導人對新四軍創建敵后抗日民主根據地、開展游擊戰爭的最早的綱領性指示，史稱第一個“五四”指示。

　　新四軍創建時下轄四個支隊、十個團、一個特務營，共1.03萬余人，槍6200余支。新四軍第一支隊司令員陳毅，副司令員傅秋濤，參謀長胡發堅，政治部主任劉炎，下轄第一、二團；新四軍第二支隊司令員張鼎丞，副司令員粟裕，參謀長羅忠毅，政治部主任王集成，下轄第三、第四團；新四軍第三支隊司令員由新四軍參謀長張云逸兼任，副司令員譚震林，參謀長趙凌波，政治部主任胡榮，下轄第五、第六團；新四軍第四支隊司令員高敬亭，參謀長林維先，政治部主任蕭望東，下轄第七、第八、第九團、手槍團和直屬隊。
　　軍部機關和直屬隊的編制及干部配備的情況是：司令部參謀處處長賴傳珠，秘書處秘書長李一氓．副官處處長黃序周，軍需處處長葉輔平，軍醫處處長沈其震，兵站處處長張元壽，軍法處處長李一氓，政治部秘書長黃誠，組織部部長李子芳，宣傳教育部部長袁國平兼，民眾運動工作部部長鄧子恢兼，敵軍工作部部長林植夫，后方留守處主任羅湘濤，政治處主任吉洛。新四軍創建之初，干部嚴重缺乏。軍部移駐南昌后，便調集干部，創辦了新四軍的第一個教育機構“新四軍教導大隊”，軍部遷移皖南后，8月22日擴編為“新四軍教導總隊”。學員來自參加南方三年游擊戰爭的紅軍戰士，后又從江南淪陷區參軍的抗日青年中選取了幾批學員。教導總隊總隊長由新四軍副參謀長周子昆兼任，政委是袁國平。
　　為了從事文化藝術和民運工作，1938年1月，新四軍在南昌成立了戰地服務團，團長朱克靖，副團長先后為吳仲超、白丁（徐平羽）、謝云暉。1939年3月30日，新四軍第一支隊司令員陳毅以《十年》為題賦詩，謳歌從國民革命軍第四軍、中國工農紅軍第四軍到新四軍的光榮戰斗歷程。這首詩后經副軍長項英、政治部主任袁國平等集體討論修改，由新四軍教導大隊文化隊隊長、音樂家何士德作曲，定名為《新四軍軍歌》，并于1939年7月1日慶祝中國共產黨誕生18周年的晚會上首次正式演唱。1941年皖南事變后，戰地服務團撤銷，部分團員改建為第一師戰地服務團。新四軍戰地服務團為新四軍的文化建設和民運工作做出了貢獻，并為部隊和地方輸送了400余名干部。
　　新四軍創建之初，人數不多，裝備落后，但他們是經歷南方三年游擊戰爭的磨煉和考驗而保存下來的精華，是忠于祖國、忠于人民、忠于共產主義事業的優秀兒女，在中國共產黨的領導下，在抗日戰爭的烽火中，新四軍成為華中地區堅持敵后抗戰的中流砥柱。

　　1936年1月，中共鄂豫邊省委組建了一支紅軍游擊隊，在信陽、確山縣境活動。同年春省委書記張星江犧牲后，游擊隊分散活動于信陽、唐河、駐馬店地區。9月，王國華繼任省委書記，領導游擊隊在確山、信陽一帶活動。全面抗日戰爭爆發后，紅軍游擊隊發展到1000余人。
　　南方紅軍游擊隊在三年游擊戰爭中，在被分割、被封鎖的環境中各自獨立地與數十倍于己的敵人進行長期的殊死搏斗，戰勝了難以想象的困難，經受了嚴峻的考驗，取得了南方三年游擊戰爭的勝利，并為新四軍的組建與發展準備了良好的基礎。

　　1934年11月，在湘南堅持斗爭的紅軍獨立第4團和游擊隊，在國民黨軍的圍剿下，受到極其嚴重損失，中國共產黨湘南特別委員會書記彭林昌犧牲。不久，又組織了湘南紅軍獨立大隊，在宜章的騎田嶺一帶山區堅持游擊活動。與此同時，有一支紅軍游擊隊在耒陽、安仁縣境內堅持活動。1938年初，上述兩支紅軍游擊隊集中時，共有300余人。

　　1934年8月，紅軍第六軍團離開湘贛革命根據地進行長征后，留在根據地堅持斗爭的地方武裝和游擊隊共5000余人，在國民黨軍的進攻下，受到嚴重損失，湘贛軍區司令員彭輝明犧牲，余部分散在羅霄山脈之武功山、九隴山山區活動。1935年7月，中共湘贛臨時省委書記譚余保將失散的部隊收集起來，編成游擊支隊，并成立了以譚余保為主席的軍政委員會和以曾開福為司令、譚余保兼政治委員的游擊司令部。此后，紅軍游擊隊分別在湖南省的酃[líng]縣、茶陵、攸縣、醴陵和江西省的萍鄉、宜春、安福、永新、寧岡、蓮花等縣境內及吉安縣之官田附近堅持游擊戰爭，先后取得攻克安福、油田、官田等戰斗的勝利。至1937年11月，紅軍游擊隊尚保存近400人。

　　1934年11月，紅軍第十六師1100余人，由中共湘鄂贛省委書記陳壽昌、湘鄂贛軍區司令員徐彥剛等指揮，在崇陽、修水、平江等縣境內堅持游擊戰爭，陳壽昌不幸犧牲。至1935年5月，先后取得大源、高枧、虹橋、三界尖等戰斗的勝利，紅十六師發展到5000余人，之后，紅十六師在國民黨軍反復進攻下，受到很大損失，徐彥剛犧牲，余部1000余人由繼任省委書記傅秋濤等率領，繼續在湘鄂贛邊地區堅持游擊戰爭，先后攻克汨羅、文家市、宜春等城鎮，保存了黃金洞等幾塊游擊根據地。至1937年8月，紅軍游擊隊尚存約900人。

　　1935年2月，由浙皖贛邊突圍回到閩浙贛革命根據地的紅軍第十軍團一部，組成中國工農紅軍挺進師，師長粟裕，政治委員劉英，共500余人。接著，挺進師由閩浙贛革命根據地出發，于3月下旬進到閩浙邊地區的江山、浦城、龍泉、遂昌、松陽(今屬遂昌)等縣邊界地區，開展游擊活動。至9月，開辟了浙西南游擊區，挺進師發展到近1000人。9月中旬，國民黨軍向浙西南游擊區進攻，挺進師以一部兵力在原地堅持斗爭，主力轉至閩浙邊地區打擊國民黨軍。1936年6月，挺進師乘國民黨軍他調之機，廣泛進擊。至年底，活動區域擴展到浙南之衢州、處州(今麗水)、溫州、臺州(今臨海)等30余縣，部隊發展到約1600人。1937年上半年，挺進師在國民黨軍的進攻下，受到較大損失，至9月，部隊尚有約400人。